细胞状态不佳是转染后细胞死亡的主要原因之一。

（1）细胞活性低

活性低的细胞耐受外界应激的能力差，转染操作和试剂刺激会进一步加剧损伤。

（2）传代次数过多

细胞传代次数过多，会发生基因变异、老化，生长状态和转染效率会下降，对转染试剂的耐受性也会变差。

（1）密度过低

细胞数量太少，细胞间缺乏必要的联系和生存信号，本身存活率就不高，转染试剂的毒性会更容易杀死它们。

（2）密度过高

细胞密度太高（例如超过90%），转染效率会降低，且细胞更容易因营养竞争和接触抑制而在转染后大量死亡。

最佳转染密度通常在70%-90%之间，需根据不同细胞系和转染试剂进行优化。

转染试剂浓度过高会破坏细胞膜结构。某些阳离子脂质体类试剂浓度过高时会与细胞膜发生过度相互作用，破坏膜的完整性。

试剂与细胞匹配性也不容忽视。不同类型的转染试剂（阳离子脂质体、聚合物等）其作用机制和适用细胞范围不同。选择不匹配的试剂不仅转染效率低，还会产生较强毒性。

转染试剂的保存条件也同样关键。

部分转染试剂需低温避光保存，保存温度波动大或反复冻融会导致成分降解，使用变质的试剂会显著增加对细胞的毒性。

（1）内毒素残留

内毒素是最常见的“隐形杀手”。用传统的碱裂解法制备质粒，如果去内毒素不彻底，微量的内毒素就会在转染时引发强烈的细胞毒性反应和炎症反应，导致细胞大片死亡。

对于转染实验，建议选择无内毒素或去内毒素的质粒提取试剂盒。

（2）杂质残留

质粒溶液中残留的蛋白、RNA、盐分等杂质会干扰复合物的形成并增加毒性。

浓度过低往往需要增加转染试剂用量，增加毒性；

浓度过高则会加重细胞代谢负担，干扰细胞正常功能。

载体大小、启动子属性等因素都会影响转染效果。一般4000-10000bp的质粒较适合转染，过大的质粒转染效率会降低。

胰酶浓度过高或消化时间过长会破坏细胞膜结构；

消化后未及时终止消化或吹打细胞力度过大，都会导致细胞在转染后难以存活。

转染和复合物孵育期间必须使用无抗生素的培养基。

若使用含有抗生素的培养基，转染试剂会使细胞膜通透性增加，抗生素（如青霉素-链霉素）会趁机进入细胞，达到毒性浓度，从而杀死细胞。

将转染复合物直接滴加到细胞上时，如果速度太快、没有均匀滴加，会导致局部浓度过高，瞬间杀死该区域的细胞。

过早更换培养基会影响质粒导入；

过晚更换则会导致营养物质消耗和代谢废物积累。

温度波动会严重影响细胞状态。过高温度导致蛋白质变性，过低温度抑制细胞代谢，都会降低细胞抵抗力。

CO₂浓度不合适会影响培养基pH值。浓度过高导致环境过酸，浓度过低导致环境过碱，都会影响细胞生理功能。

培养基污染或变质是致命因素。微生物污染不仅消耗营养还会分泌毒素；变质的培养基无法满足细胞生长需求。