原因：

模板不纯（如残留盐分、苯酚、蛋白质），或者模板线性化不完全（环状质粒会产生超长RNA，消耗原料）。

解决办法：

纯化：对酶切后的DNA模板进行胶回收或柱纯化，确保“工作台”干净。

彻底线性化：使用足量的限制性内切酶，并延长消化时间。酶切后跑胶验证，确保条带单一。

原因：

NTPs（原料）浓度过低或部分降解；Mg²⁺浓度不匹配。

解决办法：

使用新鲜NTPs：确保NTPs溶液未反复冻融，pH值正确。

优化Mg²⁺浓度：可以进行一个小型的Mg²⁺浓度梯度实验（例如6-10mM），找到最优条件。

原因：

 实验操作或试剂中被引入了RNA酶，它会在转录的同时疯狂降解产物。

解决办法：

无菌操作：使用RNase-free的枪头、离心管和水。

手套常换：手上全是RNA酶，操作时必须戴手套。

环境清洁：用RNase清除剂擦拭台面和仪器。

原因：

这是最常见的原因之一。DNA模板线性化不完全，RNA聚合酶跑过酶切位点后继续转录，产生比预期长的RNA。

解决办法：

确保DNA模板彻底线性化：使用足量的限制性内切酶，并延长消化时间。酶切后跑胶验证，确保条带单一。

原因：

T7、SP6等RNA聚合酶在转录结束时，有时会在3'端随机地多加几个核苷酸。

解决办法：

优化反应条件，或在模板设计时，在酶切位点前引入一个能形成发卡结构的序列，这能有效地告诉聚合酶“到此为止”，提高转录终止的精确性。

原因：

产物被RNA酶降解，导致条带模糊、拖尾或消失。

解决办法：

严格遵守无菌操作。转录完成后可立即加入EDTA终止反应，并尽快进行纯化。

原因：

5'端帽子结构是核糖体识别mRNA并启动翻译的“钥匙”。帽子结构不完整或效率低，会导致mRNA无法被有效翻译。

解决办法：

共转录加帽： 在转录反应中，使用类似m7G(5')ppp(5')G的“帽子类似物”代替一部分GTP，让聚合酶在合成时直接把帽子戴上。这是目前最主流和高效的方法。酶法加帽： 转录完成后，使用加帽酶和2'-O-甲基转移酶进行加帽和加尾，能获得更接近天然的真实帽子结构，但步骤更繁琐。